La cloroquina 131

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Se necesitan urgentemente un tratamiento combinado con ABT-737 y la cloroquina en modelos preclínicos de fondo pequeño cáncer de pulmón de células nuevas terapias para pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). La quimioterapia y terapias dirigidas, incluyendo el inhibidor de Bcl-2 ABT-737, pueden inducir la autofagia de células tumorales. La autofagia puede promover la supervivencia de las células cancerosas bajo el estrés y comprender una vía de escape de terapias citotóxicas. Métodos Se exploraron la combinación de ABT-737 y la cloroquina, un inhibidor de la autofagia, en modelos preclínicos de SCLC. Estos cultivo celular incluyeron análisis de la viabilidad y de la autofagia y la inducción vía apoptótica, así como in vivo análisis de eficacia en varios modelos de xenoinjerto. Resultados del tratamiento de combinación de líneas SCLC con ABT-737 y la cloroquina disminución de la viabilidad y el aumento de la activación de caspasa-3 durante el tratamiento con cualquiera de los agentes solo. ABT-737 indujo varias características de la autofagia. Sin embargo, desmontables de beclin-1, un regulador clave de la entrada en la autofagia, disminuye la eficacia de ABT-737, lo que sugiere que o bien los efectos de la cloroquina eran no específica o que la finalización de la inducción, pero no de la autofagia es necesario que el efecto combinado de ABT - 737 y cloroquina. ABT-737 y la cloroquina en líneas celulares de SCLC downregulated MCL-1 y upregulated NOXA, ambos de los cuales pueden promover la apoptosis. El tratamiento de ratones portadores de tumores demostraron que la cloroquina podría mejorar inhibición del crecimiento tumoral mediada por ABT-737 contra xenoinjertos de NCI-H209, pero no alteró la respuesta ABT-737 en tres modelos de xenoinjertos primarios derivados del paciente. Conclusión Estos datos sugieren que a pesar de ABT-737 puede inducir la autofagia en el CPCP, la inhibición de la autofagia por cloroquina no altera notablemente en respuesta in vivo a ABT-737 en modelos preclínicos relevantes, argumentando en contra de esto como una estrategia de tratamiento para el CPCP. Palabras clave autofagia Apoptosis ABT-737 cloroquina xenoinjerto primaria Antecedentes La autofagia es un proceso conservado evolutivamente, reversible en el que la célula degrada sus propios componentes citoplasmáticos de utilizar vías lisosomales. Típicamente, la autofagia se activa en condiciones de estrés celular, incluyendo la privación de nutrientes, factores de estrés ambiental, la acumulación de proteínas mal plegadas, y la interrupción de señal de factor de crecimiento. componentes citoplasmáticos son secuestrados en vesículas de doble membraned, o autofagosomas, que luego se fusionan con los lisosomas y el material contenido se degrada a los aminoácidos ácidos, nucleótidos, azúcares y ácidos grasos que se liberan en el citoplasma de la biosíntesis y el metabolismo 1. 2. La evidencia reciente sugiere que la autofagia es frecuentemente activa en las células tumorales tratadas con quimioterapia y radiación 3 7. Mientras que la activación persistente de la autofagia puede conducir a la muerte de las células tumorales, la evidencia acumulada sugiere que puede servir como vía de protección para las células para escapar de la muerte celular por apoptosis, lo que permite la supervivencia a través de períodos de estrés, factor de crecimiento de la retirada, o la privación de nutrientes 8. 9. Varios estudios han demostrado que la autofagia retrasado la muerte apoptótica en células de cáncer que reciben tratamiento quimioterapéutico. El tratamiento de estas células con inhibidores de la autofagia, como la cloroquina, o desmontables de genes esenciales autofagia (beclin-1, genes ATG) dio lugar a aumento de la apoptosis inducida por el tratamiento 10 14. La cloroquina actúa como un inhibidor lisosomal pH, por lo tanto, la prevención de la fusión de autofagosomas con los lisosomas y la inhibición de las últimas etapas de la autofagia 15. 16. Estos hallazgos han llevado a la iniciación de múltiples ensayos clínicos que combinan los inhibidores de la autofagia y agentes quimioterapéuticos para diversos tipos de cáncer 17. El cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) comprende aproximadamente el 15 de todos los cánceres de pulmón y es una enfermedad muy agresiva 18. SCLC se caracteriza por una rápida proliferación y diseminación temprana a los sitios metastásicos. Mientras nivel de atención quimioterapia basada en platino induce respuestas en el 80 de los casos recién diagnosticados de SCLC, estas respuestas son de corta duración: la mediana de supervivencia en pacientes con CPCP avanzado es de aproximadamente 9 meses desde el momento del diagnóstico 19. Las nuevas terapias se necesitan críticamente para esta enfermedad. La proteína anti-apoptótica de Bcl-2 se sobreexpresa en la mayoría de los casos de SCLC 20. 21. Supresión de la Bcl-2 puede desencadenar la apoptosis en SCLC, y mejorar la eficacia anti-cáncer de terapias citotóxicas 22. ABT-737, un Bcl-2 dominio de homología 3 mimético (BH3), que inhibe la actividad de Bcl-2 y Bcl-X L. se ha demostrado que tienen una potente actividad contra muchas líneas celulares de SCLC 23. Sin embargo, la eficacia de ABT-737 es variable a través de las líneas celulares de SCLC, y este agente sólo tiene actividad como agente único modesta contra la mayoría de los modelos de xenoinjertos primarios de SCLC 24. En consonancia con el nivel observado de la actividad en xenoinjertos primarios, mientras que los ensayos clínicos de ABT-263 (un derivado biodisponible por vía oral de ABT-737 para uso humano) han mostrado evidencia farmacodinámica de la actividad en el blanco, la tasa de respuesta global en pacientes de SCLC ha sido 25. 26 decepcionante. La hipótesis de que la resistencia a la SCLC ABT-737 puede ser en parte debido a la inducción de las células cancerosas de la autofagia. Bcl-2 se ha demostrado que se unen directamente e inhibir Beclin-1 (BECN1), un mediador crítico de la iniciación de la autofagia 27. El tratamiento de células HeLa y MCF7 con ABT-737 o gosipol, otro supuesto mimético BH3, se ha demostrado que inhiben la interacción de Beclin-1 y Bcl-2 / Bcl-X L y estimular la autofagia 28 30. Hemos tratado de definir si el tratamiento de la CEP líneas celulares con ABT-737 induce la autofagia y si esta inducción es un mecanismo de resistencia terapéutica. También se evaluó la eficacia in vivo de la combinación de ABT-737 y la cloroquina utilizando modelos derivados del paciente xenoinjerto (PDX) de SCLC. Resultados Para evaluar si un inhibidor de la autofagia podría afectar a la viabilidad de las líneas celulares de SCLC, y podrían aumentar la eficacia del inhibidor de Bcl-2 ABT-737, que trata inicialmente varias líneas celulares de SCLC (H82, H209 y H345) con ABT-737 , cloroquina, o la combinación de ambos agentes. La evaluación cuantitativa de células viables se realizó a las 72 horas usando un ensayo de MTS estándar. En las tres líneas celulares, la combinación de ABT-737 con cloroquina disminuyó significativamente la viabilidad celular en relación con cada agente por separado (p 0,002 para los tres, véase la Figura 1 A). El tratamiento de combinación de ABT-737 con los inhibidores de la autofagia resultados en disminución de la proliferación en CEP líneas celulares. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con DMSO, ABT-737, la cloroquina (CQ), y la combinación de ABT-737 y la cloroquina. A las 72 horas post-tratamiento que se analizaron utilizando el ensayo de proliferación celular MTS. Comercialmente disponibles líneas celulares se muestran en A y líneas celulares derivadas a partir de cultivos de paso de bajos de xenoinjertos de pacientes primarios en B. Las dosis elegidas estaban basadas en la determinación inicial de los valores de IC50 y fueron los siguientes: H82 (17 M ABT-737, 16,5 M cloroquina), H209 (0,5 M ABT-737, 20 M cloroquina), H345 (0,25 M ABT-737, 94 M cloroquina), LX22 (6 M ABT-737, 40 M cloroquina), y LX33 (0,8 M ABT-737, 33 M cloroquina). C. Se realizaron tratamientos similares combinando ABT-737 y 3-metiladenina, otro inhibidor de la autofagia. 3 dosis-metiladenina eran 5 mm para ambas líneas. Las barras de error: desviación estándar (SD) n 4. Hemos informado anteriormente sobre una serie de tumores PDX, generada por la transferencia directa de tumor humano en ratones inmunosuprimidos, que hemos utilizado como una plataforma para el ensayo preclínico de nuevas estrategias terapéuticas, incluyendo ABT - 737 24. 31. Para correlativa análisis in vitro, también hemos generado líneas celulares derivadas de dos de estos xenoinjertos primarios, LX22 y LX33. Las líneas celulares derivadas de LX22 y LX33 tanto demostraron una mayor pérdida de viabilidad, como se determina por MTS, en respuesta a la combinación de ABT-737 y la cloroquina que a cualquier agente solo (p 0,003 para ambos, véase la Figura 1 B). Estos resultados sugieren que la inhibición de la autofagia podría mejorar la eficacia de ABT-737. Alternativamente, la cloroquina podría tener un efecto citotóxico relacionado con la inhibición de la autofagia en estas células. Hemos interrogado esta intersección entre las vías de apoptosis y la autofagia mediante un inhibidor farmacológico alternativo de la autofagia, 3-metiladenina (3MA). El tratamiento con 3MA, con o sin ABT-737, en H209 y células H345 resultó en resultados similares a los obtenidos con la cloroquina: clara evidencia de respuesta citotóxica mejorada en las células tratadas con la combinación en relación con cada agente por separado (p 0,0015 para ambos, ver Figura 1 C). A continuación trató de caracterizar si los efectos combinatorios observados en las células tratadas con ABT-737 y la cloroquina se asociaron con una mayor apoptosis, como la hipótesis. La activación de caspasa-3 es un sello central de la inducción de apoptosis a través tanto de la vías extrínseca e intrínseca de apoptosis. La combinación de ABT-737 y cloroquina resultó en niveles más altos de la caspasa-3 de activación relativo a cualquiera de los tratamientos por sí solo en varias líneas SCLC (Figura 2 A), y en las líneas celulares derivadas de xenoinjertos de pacientes primarios (Figura 2 B). La cloroquina resultó consistente en una menor activación de la caspasa-3 que ABT-737, y en algunas líneas, incluyendo las dos líneas derivadas de xenoinjertos de pacientes primarios dirigidos a casi ninguna activación de la caspasa-3 como agente único, sin embargo, un aumento sustancial de caspasa-3 activada cuando se combina con ABT -737. La combinación de los resultados de la cloroquina ABT-737 y un aumento de la inducción de la apoptosis en líneas celulares de SCLC. Las células se trataron a las dosis enumeradas en la Figura 1 para ABT-737 y la cloroquina o la combinación durante 72 horas, y luego se ensayaron usando el ensayo de la caspasa-Glo 3/7. Luminiscencia es directamente proporcional a la cantidad de activación de la caspasa-3. Comercialmente disponibles líneas celulares se muestran en A y líneas celulares derivadas de xenoinjertos de los pacientes se muestran en B. Las barras de error: SD n 4. Tras la activación de la autofagia, la proteína LC3-I es la fosfatidiletanolamina (PE) conjugado para formar LC3-II y se transloca preferentemente a las membranas de autofagosomas. La aparición de una banda de LC3-II en transferencias de Western es un indicador aceptado generalmente de la autofagia 32. Si la inducción de apoptosis por ABT-737 conduce a una respuesta de autofagia protector en las células cancerosas, entonces podríamos esperar ver los marcadores detectables de la autofagia regulada al alza después de la exposición ABT-737, en particular en el contexto de disminución de flujo a través de la vía de la autofagia por el tratamiento concomitante con cloroquina . Para probar esta idea, se realizó un producto similar, individual y tratamientos de combinación de fármacos, y la proteína aislada de borrar para los niveles de LC3-II. No LC3-II fue detectable en las células de control tratadas con vehículo, o en células tratadas con agente único ABT-737, pero fue evidente en todas las líneas celulares cuando se trataron con cloroquina, y aún más reforzada por la combinación de cloroquina y ABT-737 ( Figura 3 A). Medición de los niveles LC3-II mostró que para cada línea celular, se produjo un aumento en LC3-II en el tratamiento de combinación en comparación con cloroquina sola (Figura 3 B). Estos datos sugieren que ABT-737 puede, de hecho la autofagia gatillo, como sugerido anteriormente 33, pero que el flujo a través de la vía impide la detección de LC3-II a menos que un inhibidor de la finalización de la digestión autophagic tales como cloroquina está presente. Para evaluar de manera más concluyente si ABT-737 induce la autofagia, se examinaron ABT-737 líneas celulares tratadas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) para buscar la presencia de autofagosomas característicos. Imágenes representativas se muestran en la Figura 3 C y los datos cuantitativos presentados en la Figura 3 D confirmar un pequeño aumento dependiente de la dosis en la formación de autophagosome en respuesta a ABT-737 tanto en H209 y células H345 (Figura 3 C y D). Sin embargo, la significación estadística solamente se alcanzó en H209 al comparar el tratamiento 0,5 M ABT-737 para el control (p 0,025). El tratamiento ABT-737 induce la autofagia en CEP líneas celulares. A . Las líneas celulares se trataron con dosis de ABT-737, CQ, o la combinación en dosis indicadas en la Figura 1 durante 72 horas. Proteína lisados ​​se recogieron y transferencias de Western utilizando anticuerpos realizaron para LC3 y actina. intensidades de las bandas B. LC3-II de las transferencias de Western muestra en una de las células tratadas con CQ frente a ABT 0,05 respecto al vehículo DMSO. Si bien tanto la cloroquina y 3MA aparecieron para mejorar la eficacia de ABT-737 contra SCLC, estos agentes farmacológicos podrían ambos estar influyendo en la proliferación celular y la apoptosis a través de vías distintas de la autofagia. Además, la cloroquina puede afectar a la terminación de la autofagia en células comprometidas a la inducción de autofagia, en vez de influir en la iniciación de esta vía. Para diseccionar aún más las posibles interacciones entre las vías de la apoptosis y la autofagia en SCLC, hemos adoptado un enfoque genético, utilizando shRNA desmontables de BECN1 tanto en células H345 (Figura 4 A) y H209. Beclin-1 es de particular interés, tanto una proteína de la autofagia esencial que controla los primeros pasos de compromiso autofagia, y como un socio de unión conocido de los objetivos principales de ABT-737, Bcl-2 y Bcl-x L. Sorprendentemente, y en contraste con los resultados obtenidos con la cloroquina y 3MA, desmontables de BECN1 disminución de la activación de caspasa-3 en respuesta a ABT-737 y la combinación de ABT-737 y la cloroquina (Figura 4 B). Desmontables de Beclin-1 disminuye el efecto de ABT-737. A . shRNA desmontables de BECN1 (KD) o revueltos de control (SCR) se llevó a cabo en H209 y H345 células. Después de la selección de puromicina, lisados ​​de células fueron cosechadas y el análisis de transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos específicos para Beclin-1 o GAPDH. B. Las células se trataron con ABT-737 (0,1 M), CQ (12,5 M) o la combinación durante 72 horas y luego se ensayaron usando el kit de la caspasa-Glo 3/7. El eje y muestra diferencias en la activación de caspasas entre los tratamientos en comparación con las muestras tratadas DMSO doblar. Las barras de error: SD n 4. efectos supresores similares sobre la inducción de apoptosis se observaron en H209 y H345. Tomados en conjunto con los datos que demuestran que ABT-737 puede activar la autofagia (como se determina por los niveles de LC3-II y la formación de autophagosome), y que los dos inhibidores de la autofagia (cloroquina y 3 mA) pueden aumentar ABT-737 eficacia, los resultados totalmente inesperados obtenidos usando BECN1 knockdown sugerir que el complejo de Bcl-2 y Beclin-1 puede tener importancia funcional en la regulación de la apoptosis por Bcl-2, independiente del efecto supresor sobre la autofagia. Es posible que los inhibidores de la autofagia se usa aquí podrían tener efectos biológicos en la regulación de la supervivencia celular independiente de la vía de la autofagia. En particular, la resistencia a ABT-737 en las líneas celulares de SCLC se ha asociado con el aumento de expresión del miembro de la familia Bcl-2 anti-apoptótica de Mcl-1, que no se inhibe eficazmente por ABT-737, y la disminución de expresión de NOXA, un pro - apoptótica miembro de la familia Bcl-2 que inhibe MCL-1 34. Lo que es más, la cloroquina y 3-MA se han mostrado disminuir MCL-1 de expresión en neutrófilos 35. En conjunto, estas observaciones sugieren una alternativa y mecanismo potencialmente complementario por el cual la combinación de ABT-737 y la cloroquina podría inhibir con eficacia el crecimiento de SCLC. Para explorar si estos mecanismos podrían ser operante en nuestras líneas celulares, se realizó la transferencia Western de MCL-1, NOXA, y otros miembros de la familia Bcl-2 pertinentes en H82, H209 y células H345 tratadas con ABT-737, cloroquina, o combinaciones de ambos agentes. Como se ve en la figura 5. En al menos dos de estas líneas (H209 y H345), la terapia de combinación se asoció con una marcada disminución de MCL-1. H209 no expresó detectable NOXA bajo cualquier condición, pero en las otras dos líneas, la terapia de combinación también se asoció con NOXA upregulation. Estos datos sugieren que al menos parte del efecto combinatorio de ABT-737 y la cloroquina puede ser mediada por la alteración en el equilibrio relativo de pro - y los miembros de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas, la promoción de la muerte celular. ABT-737 y la terapia de combinación de cloroquina altera los niveles de expresión de factores reguladores de apoptosis en SCLC. Las líneas de células H82, H209 y H345 se trataron con DMSO (control), ABT-737, CQ, y se aislaron las combinaciones de los dos fármacos durante 72 horas antes de lisados ​​de proteínas. Las dosis de ABT-737 y CQ que estaban por debajo o se aproxima a la línea de células específicas se eligieron los valores de IC50 para cada agente. Beta-actina se muestra como un control de carga interna y escindido con PARP se muestra para la inducción relativa de la apoptosis. NOXA fue indetectable en H209 y Bcl-2 fue apenas detectable en H82. Por último, dado el aumento de la citotoxicidad observada visto in vitro a través de la combinación de ABT-737 y la cloroquina, hemos tratado de explorar si esta combinación podría mejorar el control del tumor in vivo. Cohortes de xenoinjertos establecidos tumorales de la línea celular H209, así como tres modelos SCLC PDX, LX22, LX33, y LX44, fueron tratados con inyección intraperitoneal diaria de cloroquina, ABT-737, combinación, o el volumen de los controles tratados con vehículo, y el tumor se controló con el tiempo. La combinación era superior al tratamiento con agente único en los xenoinjertos de H209 (p 0,005 para la comparación con ABT-737 solo), pero no mostró evidencia de la superioridad sobre ABT-737 sola en el tratamiento de los modelos de xenoinjertos primarios (p 0,5 para la comparación con ABT -737 solo en los xenoinjertos primarios) (Figura 6). El p-valor de interacción sigue siendo importante para el H209 con una corrección de Bonferroni para múltiples ensayos (p 0,02). Combinación de ABT-737 y la cloroquina no da como resultado un aumento de la eficacia en modelos xenoinjertos. Tumor teniendo ratones Nu / Nu (47 por grupo de tratamiento) se trataron diariamente con ABT-737 (100 mg / kg, IP), CQ (60 mg / kg, IP), la combinación, o una cantidad igual de control del vehículo para 1821 día . Los volúmenes tumorales se midieron cada tres días. Grupo significa y se muestra el error estándar de la media para cada medición. Discusión En este estudio hemos tratado de evaluar si la eficacia del inhibidor dirigido Bcl-2, ABT-737, contra SCLC podría mejorarse mediante la inhibición de la autofagia concurrente con la cloroquina agente clínicamente disponibles. In vitro análisis de la combinación de ABT-737 y la cloroquina en varias líneas celulares de SCLC mostró una disminución de la viabilidad y un aumento concomitante en la activación de la caspasa-3. Además, hemos encontrado pruebas de que el ABT-737 autofagia inducida en varias líneas celulares mediante la conversión de LC3-I a LC3-II visto en las transferencias Western y el aumento de la formación autofagosoma como se documenta por TEM. Sin embargo, un enfoque genético dirigido a bloquear la entrada en la autofagia basado en shRNA desmontables de BECN1 produjo el resultado contrario: una disminución constante en respuesta apoptótica a ABT-737, con o sin cloroquina. Hay varias explicaciones posibles para estos resultados aparentemente contradictorios. En primer lugar, los efectos observados con cloroquina pueden no haber sido específica a la vía de la autofagia. De hecho, hemos sido capaces de demostrar que la combinación de ABT-737 y la cloroquina puede conducir a una marcada inhibición de MCL-1 y la regulación al alza de NOXA, los cuales servirían para facilitar la inducción de apoptosis, independiente de un efecto sobre la autofagia. Se sabe que la cloroquina puede actuar también en varias otras vías, incluyendo los implicados en la modulación inmune y daños en el ADN 17. En segundo lugar, mientras que la cloroquina inhibe las últimas etapas de la autofagia, es decir, la fusión de autofagosomas con los lisosomas que conduce a la degradación de los contenidos vesiculares, se requiere Beclin-1 para un compromiso inicial hacia la autofagia. Es posible que la iniciación satisfactoria de la autofagia sin la capacidad de completar el proceso conduce a la acumulación intracelular de materiales tóxicos, lo que lleva a la muerte celular apoptótica mejorada, mientras que el bloqueo de la entrada en esta vía no lo hace. Algunos informes sugieren que la etapa específica de la inhibición de la autofagia puede dar lugar a diferentes resultados terapéuticos 5. 36. Nuestros datos con 3MA argumentan en contra de esta explicación, en cierta medida: 3MA inhibe la iniciación de la autofagia en una etapa estrechamente relacionada con la de Beclin-1, pero a diferencia de Beclin-1 supresión, aumentó la respuesta apoptótica a ABT-737 en varias líneas. 3MA es una clase I y clase III inhibidor de PI3K 14, y podría, como la cloroquina, tener otros efectos relevantes que conducen a la muerte celular programada mejorada. En tercer lugar, y quizás lo más intrigante, Beclin-1 y Bcl-2 se sabe que interactúan directamente, y shRNA supresión de BECN1 puede afectar a la función de Bcl-2 o la localización independiente de cualquier efecto sobre la inducción de la autofagia. Aunque los datos anteriores sugieren que Beclin-1 no afecta a la actividad anti-apoptótica o localización de Bcl-2, este hallazgo puede ser contexto y el tipo de células específicas de estos estudios se realizaron en células de carcinoma cervical HeLa y fibroblastos embrionarios de ratón 37. Un posible modelo para explicar nuestros resultados sería si Beclin-1 secuestra alguna fracción de la celular Bcl-2 lejos de la membrana mitocondrial, donde Bcl-2 actúa principalmente para suprimir la destrucción de la membrana mitocondrial externa. la pérdida selectiva de Beclin-1 podría conducir a una localización preferencial de Bcl-2 a las mitocondrias, la disminución de la eficacia ABT-737 por la regulación positiva funcional de la diana. Las nuevas observaciones de este estudio sugieren varias hipótesis comprobables que deben abordarse en estudios futuros, que pueden aportar información adicional sobre la interfaz entre los reguladores de la apoptosis y la autofagia en el CPCP. Conclusiones Varios ensayos clínicos en curso buscan para evaluar la eficacia de los inhibidores de la autofagia en combinación con terapias citotóxicas en los tipos de cáncer, incluyendo el SCLC. Los datos presentados aquí tienen importantes implicaciones para los estudios de SCLC. Diferentes estrategias para la autofagia modulación pueden tener efectos marcadamente discordantes en la eficacia de las terapias citotóxicas. Será importante para estudiar la modulación de la autofagia estrechamente en modelos preclínicos relevantes para anticipar posibles efectos combinatorios. En el trabajo que aquí se presenta, se analizaron por primera vez el efecto de la combinación de ABT-737 y la cloroquina en los modelos de SCLC, incluida la evaluación de la actividad contra los tumores PDX, modelos que pueden reflejar mejor la biología de la enfermedad que haga xenoinjertos basados ​​en la línea celular 31. 38. Nuestros datos de xenoinjerto in vivo, en particular en los tres modelos de xenoinjerto primarios, sugieren que a pesar de algunas interacciones moleculares intrigantes, la combinación de ABT-737 y cloroquina es poco probable que tenga actividad anti-cáncer significativa contra SCLC, en relación con ABT-737 solo. Métodos Líneas celulares Todas las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron en los medios de comunicación recomendada. líneas celulares de xenoinjertos primarios (LX) se derivaron de tumores de pacientes como se ha descrito previamente 31. MTS ensayos de proliferación celular Las células se sembraron por cuadruplicado y se trataron con ABT-737 y cloroquina durante 72 horas a las dosis indicadas. ensayos de proliferación celular MTS se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando el CellTiter 96 AQ ueous Móvil One Solution Ensayo de proliferación (Promega). La caspasa-Glo 3/7 ensayo. El ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega). Brevemente, 20.000 células viables de cada muestra se transfirieron a placas de 96 pocillos de paredes blancas en 75.100 l de volumen total de medio de cultivo. Se añadió un volumen igual de la caspasa-Glo 3/7 reactivo a cada pocillo. Los ensayos se realizaron por cuadruplicado. Las placas se cubrieron y se incubaron a temperatura ambiente durante 12 horas antes de medir la luminiscencia en un luminómetro de lectura de placas. La lectura de la luminiscencia es directamente proporcional a la actividad de caspasa-3. Protein Western Blot se aisló a partir de sedimentos celulares usando tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (Sigma) y se ejecuta en 10 o 12 Bis-Tris geles con MOPS o MES tampón de ejecución (Invitrogen). Las membranas se sondearon con anticuerpos para LC3, beclin-1, GAPDH, actina (Santa Cruz), MCL-1 (BD Pharmigen 559027), Bax (Santa Cruz sc-6236), Bcl-XL (Cell Signaling 2764), Bcl - 2 (Santa Cruz sc-492), NOXA (imgenex IMG-349A), PUMA (señalización celular 4976), y PARP escindida (señalización celular 5625) siguiendo las instrucciones del fabricante. Microscopía electrónica Las muestras fueron fijadas en glutaraldehído al 2,5, 3 mM de CaCl2. 1 de sacarosa, en tampón 0,1 M de sodio cacodilato, pH 7,2 durante una hora a temperatura ambiente. Después de enjuague tampón, las muestras se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1 en tampón (1 hr) en hielo en la oscuridad. Después de un enjuague DH 2 O, las placas se tiñeron con acetato de uranilo acuoso 2 (0,22 m filtrada, 1 hora, oscuro), se deshidrataron en una serie graduada de etanol y embebidos en Eponate 12 (Ted Pella) resina. Las muestras se polimerizaron a 60 ° C durante la noche. Las secciones finas, de 60 a 90 nm, se cortaron con un cuchillo de diamante en la ultramicrótomo Reichert-Jung Ultracut E y recogidos con desnudos 200 rejillas de cobre de malla. Las rejillas se tiñeron con acetato de uranilo al 2 de 50 metanol y se observaron con un Philips CM 120 a 80 kV. Las imágenes fueron capturadas con una microscopía electrónica de transmisión Técnicas de Microscopía Avanzada (1 K 1 K) de la cámara. Lentiviral shRNA cDNA y experimentos de sobreexpresión partículas lentivirales se generaron utilizando un sistema de tres plásmidos y se infectaron según el Consorcio Biblioteca de Producción ARNi y protocolos de actuación, del Instituto Broad 39. construcciones shRNA se obtuvieron de la RNAi Consortium Ancha y examinados para caída. El clon ARNhc BECN1 ID TRCN0000033550 se utilizó estos experimentos. pLKO.1-shRNA vector scramble se obtuvo del Dr. David M. Sabatini través Addgene (Addgene plásmido 1864) como se describió anteriormente 40. Los estudios in vivo modelos de xenoinjertos de tumores derivados de Pacientes LX22, LX33, LX44 y se generaron como se ha descrito previamente 24. 31. células NCI-H209 (1 10 7), o células tumorales del paciente derivada de SCLC LX22 (1,5 10 6), LX33 (1,6 10 6), y LX44 (3,5 10 6), se suspendieron en una relación 1: 1 de PBS y matrigel (BD Biosciences). Las suspensiones celulares se inyectaron subcutáneamente en los flancos trasera derecha de hembra nu / nu 6 8 semanas de edad ratones (Charles River). Los tratamientos con fármacos comenzó cuando los tamaños de tumor alcanzó 200 mm 3. Los ratones fueron tratados a diario con 100 mg / kg ABT-737 (IP), 60 mg / kg de cloroquina (IP), combinación o tratados con vehículo durante 21 días. Los tumores se midieron con un calibrador manual de cada 3 días y los volúmenes se calcularon usando la fórmula: peso del tumor (mg) longitud (mm) x ancho 2 (mm 2) / 2. Con el fin de probar si el tratamiento inhibe el crecimiento del tumor, se utilizó un modelo de efectos mixtos lineal comparando el crecimiento del tumor entre los grupos de tratamiento CQ ABT-737 y ABT-737 y, modelando el registro del tamaño del tumor con el tiempo y que incluye un término de interacción. Todos los experimentos in vivo se llevaron a cabo con la aprobación del protocolo por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de Johns Hopkins. Los análisis estadísticos Los estudiantes t-test fue utilizado para comparar los efectos del tratamiento de combinación frente a los efectos del tratamiento con un solo agente en líneas celulares. Para los análisis in vivo de si el crecimiento del tumor tratamiento inhibido, se utilizó un modelo de efectos mixtos lineal comparando el crecimiento del tumor entre los grupos de tratamiento, modelando el registro del tamaño del tumor con el tiempo y que incluye un término de interacción. Un valor de p de 0,05 fue considerado significativo. Abreviaturas Conflicto de intereses Los autores no tienen intereses en competencia con respecto a los datos que aquí se presentan. Autores de las contribuciones RLZ llevaron a cabo la mayoría de los experimentos aquí, y redactó el manuscrito. EEG realizó esencial adicional en experimentos in vitro. ID asistido con todos los experimentos in vivo. SM ayudó con los estudios moleculares y de cultivo celular. LM proporcionó un apoyo estadístico. CLH aportación intelectual clave, consejos prácticos sobre los enfoques experimentales, y ayudó con la interpretación de los datos. CMR concibe el estudio, participaron en su diseño y coordinación, y ayudó con la interpretación de los datos y la escritura manuscrita. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final. Los autores Afiliaciones Departamento de Oncología, El Centro de Cáncer Sidney Kimmel Integral en la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins Referencias Kundu M, Thompson CB: La autofagia: principios básicos y relevancia para la enfermedad. Annu Rev Pathol. 2008, 3: 427-455. 10.1146 / annurev. pathmechdis.2.010506.091842 Ver artículo en PubMed Blanca E, DIPAOLA RS: La espada de doble filo de la modulación de la autofagia en el cáncer. 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